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作者:师大云端图书馆 工夫:2019-10-28


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调理NMD通路中SMG5的miR-433的判定及miRNA-NMD-作用底物调控通路的开端研讨
【择要】在真核细胞的退化进程中构成很多mRNA质量监控机制来完成基因的精确表达,此中无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是一种紧张的转录后监控机制,可辨认含提早停止暗码子(prematureterminationcodons,PTC)的非常mRNA并对其停止降解,无效防止发生的截短卵白对细胞的迫害。此中,SMG5在NMD中饰演偏重要的脚色,SMG5是一个编码卵白基因,没有核糖核酸酶活性,但对逆转录酶的活性有促进作用,它和SMG7一同被以为与触及核酸外切途径的mRNA降解机制存在联络—经过招募磷酸酯酶2A(PP2A)惹起UPF1的脱磷酸化。microRNA(miRNA)是一类长度约为19-24nt内源性激进单链非编码小分子RNA。miRNA经过与靶基因mRNA的3’UTR特异互补联合,在转录后程度上调理靶mRNA的表达或许制止卵白的翻译,现在研讨标明,miRNA到场了很多生理及病理的进程,比方,到场了肿瘤的发作开展和转移、细胞凋亡、细胞增殖和分解的生归天学进程等。但是现在有关miRNA到场NMD通路的报道比拟少,因而,作用于NMD通路中的次要因子的miRNAs是不是介导mRNA的降解是一个值得研讨的课题,本实验以NMD通路中的要害因子SMG5为研讨工具,经过生物信息学的办法挑选出潜伏的以SMG5为靶基因的miR-433。并应用分子生物学办法研讨二者的作用干系,以及在NMD通路中所发扬的作用。次要的研讨后果如下:(1)生物信息学预测潜伏调控SMG5的miRNAs。应用生物信息学软件TargetScan等对作用于SMG53’UTR的miRNA停止预测,后果失掉了多个miRNAs,颠末挑选终极确定miR-433作为研讨工具。(2)构造表达谱的构建。应用及时定量PCR技能检测miR-433和SMG5在小鼠心、肝、肾等十二种构造的表达量,并绘制了构造表达谱。后果表现:SMG5基因在小鼠构造中普遍表达,miR-433在脑和肌肉中表达量较高。(3)双荧光素酶陈诉基因的检测。依据miR-433与SMG5基因的3’UTR联合序列,构建了野生型和渐变型荧光素酶陈诉基因pmirGLO载体。并将这两种质粒辨别与miR-433mimic和miR-433inhibitor共转入HEK-293T细胞、Hela细胞,检测相应的荧光活性,后果标明:miR-433与SMG5之间存在负调控的干系。(4)miR-433调控SMG5的表达检测。miR-433mimic转染BHK细胞后,应用RT-PCR和Westernblot检测SMG5的表达量,后果发明:SMG5的mRNA表达量明显降落(P<O.01),miR-433也低落了SMG5卵白程度;而将miR-433inhibitor转染C2C12细胞后,失掉的后果恰好相反,SMG5的表达量明显上升(P<O.01),miR-433inhibitor上调了SMG5的卵白程度。(5)应用荧光定量PCR和westernbolt检测miR-433调控SMG5底物基因GADD45B.TBL2的表达。将miR-433mimic转染细胞后,应用荧光定量PCR和westernbolt检测NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表达,后果表现:miR-433上调了TBL2、GADD45B的表达,进一步推测miR-433到场NMD通路。(6)搅扰SMG5对底物基因的影响。应用SMG5基因的siRNA,转染C2C12细胞,及时荧光定量PCR检测SMG5被搅扰后底物基因TBL2、GADD45B的表达量,后果表现:搅扰24h后,SMG5表达量较比较组明显降落(P<0.01),而TBL2、GADD45B则有差别水平的上升(P>0.05);停止Westernbolt实验,所得的后果与此符合。从以上后果,我们推测miR-433可以经过克制SMG5的表达到场NMD通路。
【作者】张芳;
【导师】任竹青;
【作者根本信息】华中农业大学,植物遗传育种与繁衍,2014,硕士
【要害词】无义介导的mRNA降解;SMG5;miRNA-433;GADD45B;TBL2;

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兔短链脂肪酸受体GPR41和GPR43基因的判定
【择要】短链脂肪酸,次要包罗乙酸、丙酸和丁酸,次要由肠道微生物发酵没有被消化和不克不及被消化的碳水化合物天生。短链脂肪酸不只是植物体内紧张的能量泉源(可提供牛60%-70%的能量需求,猪15%-24%的能量需求),并且是紧张的信号分子,在许多生理进程中发扬紧张的调理作用。2003年,有研讨标明短链脂肪酸可以激活G卵白偶联受体GPR41和GPR43,而且GPR41和GPR43与短链脂肪酸联合对机体代谢、免疫等功用具有潜伏的调控作用。迄今,关于GPR41和GPR43的研讨次要会合在人、大鼠和小鼠上,关于兔基因组中能否含有GPR41和GPR43基因及其构造、功用和构造表达状况尚未有研讨报道。本研讨,起首确定兔全基因组中能否含有与人和啮齿类植物GPR41和GPR43基因序列类似的基因。然后检测GPR41和GPR43基因能否在兔的各个构造中表达。若表达,经过巢式PCR法和卵白印迹法辨别在基因程度和卵白程度检测兔各构造中GPR41和GPR43的表达状况。1应用BLAST和DNAMAN等停止序列剖析运用BLAST比照兔的基因组与人、大鼠、小鼠、牛和山羊的GPR41基因和GPR43基因。后果标明:兔的基因组含有GPR41和GPR43基因,且兔GPR41基因序列与人大鼠、小鼠、牛、和羊的GPR41基因序列的类似性辨别为84%、80%、81%、84%和84%;兔GPR43基因序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43基因序列的类似性辨别为83%、85%、84%、79%和81%。氨基酸序列比照,后果标明:GPR41氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR41氨基酸序列的类似性辨别为70%、75%、75%、74%和74%;GPR43氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43氨基酸序列的类似性辨别为79%、81%、82%、72%和73%。2巢式PCR检测兔各构造中GPR41和GPR43mRNA的表达接纳巢式PCR技能,辨别剖析GPR41和GPR43基因在兔差别构造内]mRNA程度。后果标明:GPR41基因在除了下丘脑和垂体外的各构造中都有表达,在肝脏、结肠和脂肪构造中表达量较高;肌肉和心脏构造表达量较少。GPR43基因在各构造中均有表达,在下丘脑和脂肪构造中表达量较高;肌肉和肾上腺构造表达量较少。3卵白印迹法检测兔各构造中GPR41和GPR43卵白表达程度应用western-blot技能,辨别检测兔差别构造中GPR41和GPR43卵白的表达程度。后果标明:GPR41在除了下丘脑和垂体构造外的其他构造中均有表达,在肝脏构造中表达量较高,实行检测出的卵白巨细在55kD-70kD之间,大于GPR41目标卵白39kD;GPR43在兔的构造中均有表达,在肌肉和肺构造中表达量较高,实行检测出的卵白巨细在55kD-70kD,大于GPR43目标卵白43kD。
【作者】苏浩;
【导师】姚文;
【作者根本信息】南京农业大学,养殖,2013,硕士
【要害词】兔;GPR41;GPR43;mRNA表达;卵白表达;

【参考文献】
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加权基因共表达网络剖析(WGCNA)在食管鳞癌中的使用
【择要】食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是我国罕见的恶性肿瘤,其五年生活率不到25%,复发和转移是招致ESCC病人殒命和预后不良的次要缘由。ESCC的发作开展是一个多基因到场、多要素作用、多阶段停顿的庞大的生物学进程,它依赖于多种基因、转录本、卵白质的互相作用及调控。深化研讨ESCC的分子机制是进步ESCC诊治结果的根底。传统的生物学研讨以单个基因、转录本和卵白质的详细功用及特点为根底,虽然这种研讨办法对在分子程度上提醒生命机制起偏重要的作用,但不行否定其仅能对生物零碎的部分作出表明,无法对生物零碎的全体举动停止更为深化和片面的探究。生物网络可直观地展示生物零碎中各个功用元件之间的互相干系,为研讨生物体在零碎程度的特性提供了紧张的平台。加权基因共表达网络剖析(Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA)应用了零碎生物学的头脑寻觅基因之间表达的类似性,并将表达高度相干的基因确定为一个基因模块。本研讨将WGCNA用于ESCC表达谱数据的剖析。我们运用ESCC肿瘤构造与癌旁正常构造中差别表达的基因作为WGCNA的数据源停止剖析,共失掉8个与上皮细胞分解、细胞外基质重构、细胞周期等GO分类亲密相干的基因模块。接着,我们选择一个独立行列步队的ESCC表达谱数据来验证WGCNA剖析失掉的基因模块,发明大少数的模块在差别数据泉源的ESCC行列步队中具有分歧性,这后果标明我们的剖析办法精确且具有可反复性。最初我们结合剖析基因模块与临床信息,找到一系列与肿瘤分级、病人生活工夫、肿瘤分期等相干的基因模块。加权经过进一步剖析基因模块构造,我们失掉一系列与肿瘤分级高度相干且在模块中具有高衔接度的关键基因,这些基因对ESCC的发作开展具有潜伏的紧张作用。我们的后果标明WGCNA可以发明具有生物学意义的基因模块,且经过结合临床信息剖析所发明的关键基因也与文献报道根本符合,这也证明WGCNA剖析基因芯片数据的精确性和无效性。这是WGCNA办法第一次被用于剖析ESCC数据,对基因模块信息的进一步发掘有助于我们更深化地研讨要害基因、要害信号通路、基因之间的调控机制关于肿瘤发作开展的作用和意义。
【作者】王攀;
【导师】赫捷;
【作者根本信息】北京协和医学院,临床医学,2014,博士
【要害词】食管鳞癌;基因共表达网络;肿瘤分级;加权基因共表达网络剖析;

【参考文献】
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